顽拗植物龙眼基因组DNA提取方法的研究

为从顽拗植物龙眼(Dimocarpus longan Lour.)叶片中获得可供后续分子生物学操作的基因组DNA．针对其组织细胞内富含多酚、多糖、单宁及色素等物质的特点,采用改进的CTAB法和SDS法,即在核裂解之前先破碎细胞．将存在于细胞质中的次生物质去除后再裂解细胞桉．结合其它一些改进措施．提取到的DNA沉淀呈纯白色．极易溶解于TE中。两种改进方法的OD260和OD280比值分别达到1.82和1．73,其鲜叶基因组DNA产量分别为103ug/g和127ug／g：RAPD扩增条带清晰,丰富．完全满足后续分子生物学操作的要求,其中改良CTAB方法效果更为理想,与之埘比．传统的CTAB法和SDS法提取到的DNA沉淀呈浅黄色甚至红褐色,很难被TE溶解,其OD260和OD280比值均低于1．5,也得不到扩增产物。     

龙眼胚性愈伤组织DRM1基因的克隆及其定位与表达分析

该研究以龙眼胚性愈伤组织的转录组数据为基础,对龙眼胚性愈伤组织DlDRM1基因进行克隆和生物学信息分析,并检测其在体胚发生过程中不同发育阶段、不同浓度的外源激素(2,4-D、IAA、KT)处理下及不同组织部位的表达,以揭示DlDRM1基因在龙眼体胚发生过程中的功能。结果表明:(1)从龙眼转录组unigene序列筛选获得龙眼结构域重排甲基化酶1基因(命名为DlDRM1)全长序列,并利用RT-PCR法从‘红核子’龙眼胚性愈伤组织中克隆获得DlDRM1基因的cDNA全长序列(GenBank登录号为KY990493);DlDRM1基因cDNA全长2 574bp,包括494bp的5′UTR,184bp的3′UTR,可编码包含631个氨基酸的蛋白质。(2)生物信息学分析显示,DlDRM1是一个不稳定的亲水蛋白,不含信号肽,不存在跨膜结构域,其分子式为C_(3104)H_(4839)N_(851)O_(984)S_(28);序列比对和系统进化分析表明,龙眼DlDRM1与脐橙DRM相似度最高(76.85%),二者亲缘关系也最为接近。(3)实时荧光定量PCR分析发现,DlDRM1在龙眼各组织器官中均有表达,且在果肉中表达量最高,其次是花蕾,在叶中的表达量最低;DlDRM1基因在非胚性愈伤组织中表达量最高,而且在非胚性愈伤向胚性愈伤转变过程中DlDRM1基因的表达量呈逐步下降趋势,说明DlDRM1基因与体胚胚性呈负相关关系,在龙眼体胚发生过程中可能发挥着重要的作用;一定浓度的IAA和2,4-D能够促进DlDRM1基因的表达,而KT则抑制DlDRM1的表达。(4)亚细胞定位结果表明,DlDRM1定位于细胞核和细胞膜上。     

龙眼壳中化学成分的研究(Ⅰ)

通过多种柱色谱对龙眼壳中多酚类成分进行分离纯化及结构鉴定。结果表明：从中得到6个多酚类化合物,根据波谱数据分析及文献对比,分别鉴定为原儿茶酸(1)、没食子酸(2)、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(3)、柯里拉京(4)、乙酰甲基-老鹳草素(5)、(-)-表儿茶素(6)。所有化合物均为首次从该植物中分离得到。     

龙眼体胚发生过程生长素响应因子DlARF5a的克隆及表达分析

以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得生长素响应因子ARF5acDNA全长序列,利用实时荧光定量法检测其在龙眼体胚不同发育时期的转录水平,并将其与绿色荧光蛋白(GFP)构建成亚细胞定位载体侵染洋葱表皮细胞。结果表明:龙眼ARF5a(命名为DlARF5a,GenBank登录号为KF739401)的cDNA序列全长为3 322bp,其中开放阅读框为2 829bp,212bp 5′非编码区,258bp 3′非编码区,编码942个氨基酸。生物信息学预测显示,DlARF5a编码蛋白具有B3、Auxin-resp和AUX-IAA保守区与结构功能域,中间区域富含谷甘氨酸、丝氨酸和亮氨酸,是一个定位于细胞质的具有促进转录活性功能的水溶性蛋白。系统进化树分析表明,该基因编码的氨基酸序列与大豆的亲缘关系最近。qRT-PCR检测显示,DlARF5a在龙眼球形胚和鱼雷形胚时期表达显著增强,而在6个发育阶段中子叶形胚的表达量最低,推测DlARF5a参与龙眼体胚中鱼雷胚时期的形态建成。共聚焦显微镜观察结果显示,未添加外源生长素IAA的DlARF5a蛋白定位于细胞质中,而经外源生长素处理的DlARF5a蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核中均有表达,推测龙眼生长素响应蛋白DlARF5a能够响应外源生长素IAA而改变其在细胞中的空间位置。     

我国荔枝、龙眼病害名录

本文列出我国大陆荔枝(Litchi chinensis)、龙眼(Dimocarpus longan)生产上发生的37种侵染性病害种类及其主要为害部位,并介绍其分布情况.     

RAPD技术在龙眼品种分类中的应用研究

利用ＲＡＰＤ技术结合聚类分析,研究了龙眼（ＤｉｍｏｃａｒｐｕｓｌｏｎｇａｎＬｏｕｒ．）３５个样品的分类和亲缘关系。结果表明：“荔枝本”和“荔枝龙眼”两个品种是荔枝（ＬｉｔｃｈｉｃｈｉｎｅｎｓｉｓＳｏｎｎ．）和龙眼天然杂交种的可能性很小;“荔枝本”、“南湖焦核”等品种为变异较大的龙眼突变品种;“焦核龙眼”品种基因组间差异较大;“东壁”龙眼可能有同名异品种现象;“红核子”等实生栽培品种可能有一定的基因突变。龙眼品种拟分为６个类,其中“水涨”、“乌龙岭”、“油潭本”等１２个品种多为核大皮厚的宜制干的品种,可以归类为水涨乌龙岭类;“赤壳”、“福眼”、“蕉眼”、“处暑本”为代表的１１个品种可以划归为赤壳处暑本类;东壁系列品种分类为东壁类;“立冬本”、“南湖焦核”、“荔枝本”品种与上述品种差异较大,暂分别独立分为各自相应的类。这些结果表明ＲＡＰＤ技术有可能解答传统的龙眼形态学等分类方法所不能解决的疑难问题     

植物生长调节剂对龙眼内源激素及花芽分化的影响

研究了ＰＰ３３３和ＧＡ对龙眼（ＤｉｍｏｃａｒｐｕｓｌｏｎｇａｎａＬｏｕｒ）,成花的作用及其与内源激素的关系。结果表明,ＰＰ３３３处理后,ｉＰＡ含量明显高于ＧＡ的处理,而ＧＡ含量则呈现由高到低逐渐下降的趋势,ＧＡ处理正好相反,ＰＰ３３３处理后芽中的ＡＢＡ含量明显低ＧＡ处理,表明高含量的ＧＡ和ＡＢＡ不利于花芽分化,而高含量的细胞分裂素则有利于花芽分化,外施Ｐ３３３可缩短花序长度,提高着果率和增加产量。     

龙眼内源激素变化和花芽分化及大小年结果的关系

本文探讨了隔年结果的龙眼花芽和营养芽内源激素在成花过程中的作用及其与结果大小年的关系．结果表明：大年树的细胞分裂素ｉＰＡ明显地高于小年树,而ＧＡ和ＡＢＡ含量明显低于小年树,说明细胞分裂素有利于龙眼花芽分化,ＧＡ和ＡＢＡ不利于花芽分化．龙眼大年树细胞分裂素和赤霉素的比值显著高于小年树．外施ＰＰ３３３能促进花芽分化,具有缩短花序、提高着果率和增加产量的作用．     

龙眼组蛋白去乙酰化酶基因DlHDT1的克隆与特性分析

组蛋白去乙酰化是植物表观遗传调控的重要组成部分,对染色体结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。为深入探究组蛋白去乙酰化酶基因(histone deacetylase 1,HDT1)在龙眼体胚发生过程中的功能,该研究结合龙眼基因组数据,采用RT-PCR方法克隆得到龙眼组蛋白去乙酰化酶基因(DlHDT1),对其进行生物信息学分析及亚细胞定位观察,同时结合转录组数据分析DlHDT1在体胚发生过程中的FPKM值,并利用qRT-PCR技术检测PEG6000和NaCl处理下DlHDT1的表达模式。结果表明:(1)DlHDT1基因CDS序列全长918 bp,编码305个氨基酸,该蛋白为不稳定亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜结构,共含43个磷酸化位点,相对分子量为32 585.54 Da,等电点为4.65;进化树分析显示龙眼DlHDT1与漾濞槭亲缘关系最近(78.76%)。(2)亚细胞定位显示,DlHDT1蛋白定位于细胞核中;顺式作用元件分析发现DlHDT1基因含有大量光响应元件和脱落酸、茉莉酸甲酯等激素及逆境胁迫响应元件;转录组数据显示,DlHDT1在龙眼体胚发生不同时期均有表达,在胚性愈伤组织(EC)阶段表达最低,在球形胚(GE)阶段表达最高。(3)qRT-PCR显示,在PEG6000和NaCl处理下DlHDT1基因,呈下调表达趋势,推测DlHDT1可能参与调控龙眼对干旱及盐胁迫的响应,并存在负调控关系。研究认为,DlHDT1为核定位基因,可能参与龙眼体胚形态建成并在龙眼响应非生物逆境胁迫过程中发挥重要作用。